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多层聚合物复合纳米克林霉素微球抗感染骨科钛板的研制
日期:2018-07-04 00:00:00  浏览量:812

 多层聚合物复合纳米克林霉素微球抗感染骨科钛板的研制

黄 啸

一、项目概况

(一)名称:多层聚合物复合纳米克林霉素微球抗感染骨科钛板的研制

(二)委托单位:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院

(三)所属社会服务类别:科研服务

(四)项目实施时间:2016年11月-2017年10月

(五)项目实施地点:铜仁学院

二、项目获得过程

(一)项目来源

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(二)协议书(合同书)内容

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三、项目的目的与意义

目前因疾病、外伤导致的骨折和骨缺损仍然是临床医学面临的一大难题。针对这一难题,临床上常采用植入骨修复材料来治疗。骨修复材料主要采取自体或异体骨移植物。自体骨移植在材料来源方面存在着严重的缺陷,从自体异位取骨,无异于拆东墙补西墙,效果不理想。医用钛合金,因其材料表面的生物惰性而具有良好的生物相容性,加上其本身力学强度高,钛材在骨关节系统修复、心血管植入物、牙种植体及人工关节等人工器官方面的应用获得了重大突破。遗憾的是,虽然研究人员已经找到了合适的异体骨修复材料,但是,包括“假体周围感染”在内的“固定物相关感染”始终是困扰骨科临床的最常见而严重的并发症之一。据据国际内固定研究协会AO组织2006年报道,包括创伤骨科和脊柱外科在内的闭合性骨科手术感染率约1.5~3%,而开放性骨折中感染率最高可达40%;关节外科亦同样面临着“假体周围感染”这一灾难性并发症。资料显示:美国每年置换人工关节数量高达120万例,感染率约1~20%;每年在美国约200万例院内感染病例中,约50%与内植物有关,不仅消耗高达240亿美元的巨大社会财富,还导致截肢甚至每年10万患者死亡等严重后果。“固定物相关感染”一旦发生,为了控制感染,临床医生往往不得不取出钢板、人工关节及椎弓根螺钉等内植物。究其原因,细菌与植入物材料粘附以及形成完整的生物膜是固定物相关感染的主要病理基础。长期大量使用抗生素不但不能根除骨科器械表面细菌粘附聚集形成的生物膜,反而导致的生物膜中休眠细菌的高度耐药。资料表明:在“固定物相关感染”患者中,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌占深部检出细菌的70~90%,其中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)约60%,近来甚至出现了耐万古霉素金葡菌(VRSA),生物膜中细菌的高度耐药性导致临床面临无药可用的严重威胁。为此,寻找新的改变固定物材料表面特性的方法或物质已成为目前临床工作的迫切需要,是微生物、材料、临床医学等多领域的国内外研究焦点之一。

本研究的目的是通过研制拥有载抗生素药物并具有生物膜形成抑制功能的骨科植入用钛板功能化表面,使上述功能化表面内抗菌物质在人体内从内向外实现长效释放,直接在骨关节手术局部发挥抗菌和抑制生物膜形成与成熟,避免原有抗生素的全身静脉注射或局部外用的使用缺点,以获得防治固定物相关感染的疗效,最终使内植物——本是促进感染形成因素之一的“异物”,转化为预防与治疗骨与关节局部感染的新手段之一。以实现临床骨科医生所期盼的革命性突破:骨科器械不再仅限于固定与替代部分骨关节生理功能的作用,而是具有抗感染功能的“生物反应器”。为骨科临床工作中面临的最常见且严重的并发症 “固定物相关感染”提供预防和治疗的双重疗效。该项目的研制开发成功,不仅会给骨损伤患者带来巨大的福音,还将给我国带来巨大的经济和社会效益。

四、项目研究概况和分析

钛及钛合金材料是目前临床硬组织(骨、种植牙及人工关节)修复应用最为广泛的医用金属材料。早在20世纪中期钛材就被用于医用领域,并于70年代作为植入材料开始获得广泛应用。随着生物技术和医学的发展,钛材作为骨关节系统修复材料、心血管植入体、牙种植体及人工关节等人工器官方面的应用获得了重大突破。

钛及其合金作为植入体,因其自身的生物惰性,会使植入体组织界面的免疫能力降低,是植入体进入人体后容易发生感染,难治疗并且易复发的主要原因。一旦发生初期感染,细菌将会黏附在植入体表面,并进行快速的大量的繁殖,在植入体表面形成致密的生物膜。常规的抗生素全身静脉注射疗法难以通过人体循环进入植入体表面将细菌杀灭,因此构建具有抑菌性能的植入体是防止术后感染的有效途径。科研人员和临床工作者们试图通过各种改性方法,以提高植入物表面的抗菌性,根据改性类别可将改性方法分为两大类。一是通过改变材料表面的物理化学性质比如表面湿润性、亲疏水性、表面自由以及表面带电性质,或者改变植入体表面的形貌以达到抑制细菌黏附的效果;二是在植入体表面接载抗生素来达到抗菌的效果。对于抗细菌初始黏附,主要是改变钛材表面的物理及化学性质来实现的,如用紫外线处理过的Ti6Al4V能在不降低其组织相容性的同时抑制细菌的黏附。这是由于经过紫外线照射后钛表面的氧化钛涂层结构发生了改变,晶体锐钛型氧化涂层能够降低细菌在钛材表面的黏附能力;加载抗菌黏附涂层,如蛋白涂层:肝素、血清蛋白等,或者是用亲水链表面改性,如加载聚乙二醇基改性物涂层,该涂层上有密集的聚乙二醇链,使得钛材表面有高度亲水性,这样就能够使得钛材表面能够形成空间和渗透压屏障,减少了细菌在钛材表面的黏附。对于主动抗菌修饰,主要是通过在钛材表面构建抗菌药物缓释系统来实现的。第一种方式就是构建抗生素涂层,用具有良好可降解性和生物相容性的载体(如聚乳酸)混合抗生素直接涂布于钛板表面,局部的高浓度药物可以提高治疗的有效性,并且较传统治疗大大降低了系统的毒性。Gollwitzer曾在钛合金表面加载了包载具有缓释替考拉宁作用的D,L-乳酸(PDLLA) 涂层,使得钛合金表面的金黄色葡萄球菌吸附量明显减少;另一种方式是利用无机抗菌剂涂层,其中最具有代表性的是纳米银抗菌涂层,银具有较广的抗菌谱,较低的可能产生耐药性倾向,能抑制细菌黏附,拥有良好的生物相容性且抗菌效果持久。有研究显示Ag-nHA-nTiO2抗菌层具有良好的抗细菌黏附作用并且对于变形链球菌的抑菌率接近90%;此外,一氧化氮涂层和具有抗菌活性聚合物涂层(如壳聚糖、透明质酸等)也是制备抗菌涂层的良好选择。抗菌涂层虽然能在短时间内起到良好的抗菌效果(一般在60 h以内),但骨髓基质干细胞需要较长时间才能黏附于植入物,并在其上增殖分化。所以,单纯利用涂层法,不能完全满足临床需求。

层-层自组装(LBL)技术是近些年发展起来的一种制造薄膜的有效方法,因其操作简单,载药量大,可控缓释等优点,许多科研人员试图利用LBL技术在骨科植入物表面构建抗菌薄膜。LBL最初利用带电基板在带相反电荷中的交替沉积制备聚电解质自组装多层膜,其驱动力为静电力。例如,通过LBL技术使得带正电荷的壳聚糖和带负电荷的负载四环素的海藻酸交替沉积于被氨基化的钛材表面。四环素的持续释放能抑制细菌生长,防止细菌的黏附。此外,壳聚糖本身的抗菌性增强了钛板的抗感染能力。带负电荷的金纳米粒子和带正电的溶菌酶交替沉积于带负电荷的纤维素薄膜上。溶菌酶是先天性免疫系统的一部分,对抗感染是其在体内的主要功能之一。溶菌酶的抗菌特性主要归因于通过催化的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰- D-葡糖胺残基之间的1,4 -β-键水解来损伤细菌细胞壁。基于溶菌酶优良的抗菌性能,该LBL薄膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制效果。但是,基于静电力形成的LBL多层膜结构不够稳定,极易受到环境pH值的变化影响,造成多层膜结构的崩塌,致使药物快速释放,达不到长时间缓释的目的。因此,研究者们开始探索基于其他分子间作用力的LBL技术,其中基于共价键驱动的LBL多层膜的研究刚刚起步。另外,活性药物通常是简单吸附于聚合物薄膜中,然后组装入多层膜中,药物随着多层膜的崩解而释放,缓释效果有待提高。

基于以上分析,本项目试图在骨科植入用钛板表面构建基于共价键驱动的LBL多层膜结构,形成结构稳定的薄膜。此外,在药物负载方式上,本项目运用已熟练掌握的聚合物纳米微球包裹技术,将抗生素包裹在纳米微球内,增强缓释效果。从而在骨科植入用钛板表面构建基于共价键连接的新型的多层“纳米微球-聚合物膜”结构的抗菌膜,以期达到长效抗感染的目的,为临床应用提供坚实的理论和实验基础。

五、项目开展技术路线

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六、项目研究的主要内容

(一)钛板表面氨基化

参照文献已报道的方法,利用冷凝回流法在钛板表面接上了具有反应活性的氨基。首先将钛板用砂纸打磨抛光后使用丙酮超声清洗,10 mol/L NaOH浸泡6 h后用去离子水冲洗干净,待完全干燥后,在5% 的APTES的异丁醇溶液中回流加热6 h,停止加热,溶液中冷却浸泡12 h,分别经甲苯,无水乙醇,去离子水各洗3次后,钛板表面即接上了具有反应活性的氨基。利用氨基显色反应,测定钛板表面氨基的接枝密度。

(二)纳米载药微球的制备

利用原子转移自由基聚合(ATRP)反应制备马来酸酐接枝的聚乳酸两亲性聚合物。将已纯化的聚乳酸溶于二氯甲烷中,按比例加入马来酸酐和过氧化二苯甲酰,搅拌均匀后真空干燥,于100℃反应10 h后,提纯3次,备用。利用红外吸收光谱和核磁共振吸收波谱分析聚合物结构,凝胶色谱测定聚合物的分子量。利用酸碱滴定法测定马来酸酐的接枝率。

利用两亲性聚合物能在水中自组装形成胶束的特性,将马来酸酐改性后的聚乳酸溶于丙酮中,逐滴加入到搅拌中的硫酸链霉素的水溶液中,搅拌过夜,挥发丙酮,合成纳米载药微球。利用透射电子显微镜(TEM)观察纳米载药微球的形貌;利用动态光散射粒度仪(DLS)测量载药微球的粒径和zeta电位;利用紫外分光光度计测量未包裹的硫酸链霉素的浓度,以计算载药微球的载药量。

(三)钛板长效抗菌表面的构建

利用层层自组装技术(LBL)在氨基化的钛板表面构建基于共价键连接的新型的多层“纳米微球-聚合物膜”立体结构。将氨基化的钛板和具有一定浓度的经EDC/NHS法活化的载药微球溶液置于甩胶机中,离心甩板20 min后取出,待干燥后将钛板置于一定浓度的聚乙烯亚胺水溶液中,静置20 min,干燥。重复以上操作多次。每进行一次铺层操作后,用接触角测量仪测量每层表面的接触角,以表征每层表面的亲/疏水性;利用原子力显微镜(AFM)观察多层“纳米微球-聚合物膜”结构的表面形貌。

(四)体外释药行为的测定

组装能固定功能化钛板的流动腔,无菌操作下,将钛板置于透析袋中后,安装于流动腔中,利用蠕动泵调节流动腔中模拟体液的流动速度,使之达到生理水平。在固定的透析时间点,取透析液检测其中硫酸链霉素的含量,同时添加入等体积的新鲜模拟体液。整理数据,描绘药物累积释放曲线,观察体外释药行为。

七、项目的实施情况

(一)聚乙二醇接枝聚乳酸(PPLA)的合成

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图4  PPLA的红外光谱图

-CH3、-CH2的弯曲振动频率位于1300~1500cm-1,其中在这区间都出现了特征峰,说明是PPLA共聚物结构中有甲基和亚甲基。其次结构中还含有C=O及C─O─C官能团,在1000~1300cm-1区间有伸缩振动。所以根据图谱中的吸收峰特征可知,我们已成功的合成了PPLA共聚物。

(二)克林霉素-PPLA微球的制备

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图 5  微球的透射电镜照片

利用两亲性聚合物在水中能自组装形成胶束的特点,我们已经成功的制备了粒径在200 nm 以下的克林霉素-PPLA微球。

(三)多层膜的构建

与疏水性的钛表面相比,钛表面氨基化后使得其表面富含-NH2所以其亲水性有了较大的提高,随着膜层数的增加,钛合金表面的接触角有改变。从第五层接触角在26°到15°之间呈现有规律的变化,接触角的交替变化证明了从钛合金表面已经形成了全覆盖的、单层的微球膜。

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图6 接触角分析

(四)体外释放

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实验结果表明,将克林霉素装载入PPLA微球,并在钛材表面构建LBL膜能显著提高药物缓释效果,为抗生素的缓慢释放提供了可行的方法,实现长效抗菌。

八、项目组成员

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九、项目取得的成果

(一)科研成果

1. 发表高水平学术论文1篇

Xiao Huang, Yajuan Xu, licheng Yang, Jiaqun Wu, Xi Zheng, Jun Fei. Construction of a long-acting antibacterial surface on implanted titanium plate. Basic Clin. Pharmacol. 2017,121: 18

2. 授权发明专利《医用钛合金植入物表面药物缓释系统的构建方法》(见图)

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图 8 发明专利证书

(二)人才培养与学科建设效应

项目本身综合了化学、材料学、药学、医学等相关学科知识,因此,课题组的学生成员来自制药工程、材料物理、护理学等3个不同的专业,各自发挥各自的专业知识特长,交叉互补,发挥1+1>2的效应。项目的实施需要充分融汇《病理生理学》、《微生物学》、《制药工艺学》、《药物化学》、《药用高分子学》等课程的所学知识,这样既能巩固学生课堂上学习的内容,又能充分调动学生积极探索未知领域知识的兴趣。学生通过项目的实施,团结协作能力得到加强,并形成交叉、融汇、贯通的效应。项目培养5名本科生,其中2人已毕业,1人考上广西科技大学研究生,3名在校生也申请相关项目化课程,正在实施中。

(三)经济与社会效益

将基础科学研究成果向临床转化是本项目最终需要实现的目标。项目通过与临床医学合作,从临床实际难题出发,利用生物医学工程技术突破临床瓶颈,改善医疗效果,减少患者病痛,使得项目具有较大的经济与社会效益。

另一方面,项目委托单位为医学水平全国领先的医疗机构,而铜仁学院能在临床科学研究方面对外提供相关服务,填补了铜仁学院涉医科研的空白,扩大了铜仁学院的影响力,增强了铜仁学院的综合实力。同时,也为铜仁大健康产业的根本发展做出了一定的贡献。

十、项目取得的主要经验及启示

(一)学校层面

1.建议学校营造一个更为轻松的环境氛围。进一步发挥学校职能,为教师做项目提供项目资金、人力、政策方面的支持,为教师能够高质量地完成项目提供良好的保障。

2.综合学校的师资资源,而不应该局限于各个院系,同一类型课程,建议成立教师团队负责,而不是限于固定院系内部教师,开阔教师与学生的视野。   

(二)教师层面

1.本项目的获得,源于负责人同委托单位良好的合作关系。因为有了合作基础,才开启了新项目的合作。因此,对于合作关系的教师来说,一定要维护好前期的合作关系,也要适时拓展合作关系,为更多的委托项目提供前期基础。

2.扎实地基本功是完成项目的保证。首先老师需要有深厚的基础知识,并要不断的补充和更新自己的知识,这样才能高质量的、顺利的实施项目。老师们自身也要内涵性地发展,不做“喊口号”式的表面工作,多做实事,在夯实自身基础知识的同时,积极扩宽自身的知识面,多学习,多进步。

3.学会利用资源。铜仁学院为新建本科院校,对于能够进行基础性研究的软、硬件设施相当薄弱。因此,必须要借鸡下蛋,通过各种方法,让其他的资源为我所用,发挥资源的作用,互利共赢,使得项目得以顺利地进行。

(三)学生层面

通过科研的形式,使得学生将课堂知识充分化为己用,既激发学生学习的兴趣,又强化了学生的知识。挑战自我和团结协作的团队精神都在项目中得到锻炼,将被动学习变为主动获取。

 

                                                                                                                             (作者系铜仁学院大健康学院副教授 黄啸)

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